G蛋白偶联受体介导的蜕皮激素非基因组途径和保幼激素抑制变态的分子机理

【摘要】研究背景及存在的科学问题昆虫的生长和变态主要由蜕皮激素(20-hydroxyecdysone,20E)和保幼激素(juvenilehormone,JH)调控。在幼虫生长期高滴度JH存在的条件下,20E滴度增加调控幼虫不同龄期间的蜕皮。在末龄幼虫转变为成虫的变态期,JH滴度下降或消失,20E起始变态。20E的主要功能是促进蜕皮与变态,而JH主要维持幼虫状态。二者在体内的滴度比例交互变化,功能既拮抗又统一,协同调控昆虫发育。由于20E是小分子脂溶性激素,早期研究认为20E通过渗透进入细胞膜,与胞内受体ecdysonereceptor(EcR)结合,在热休克蛋白帮助下与超气门蛋白ultraspiracle(USP)形成EcR-USP转录复合体,结合在DNA启动子上,启动下游基因转录,实现蜕皮与变态,即20E基因组途径。目前已有一些研究报道20E能够通过细胞膜上的G蛋白偶联受体(GPCRs)引起Ca2+信号增强,蛋白快速移位和磷酸化,环腺苷酸水平升高等细胞快速应答反应,这暗示20E存在非基因组途径。JH也是小分子脂类激素,研究认为JH也是通过渗透进入细胞内,结合胞内受体methoprene-tolerant(Met)调控基因转录。20E和JH通过调控不同的基因转录控制昆虫的生长和变态。研究报道绝缘小体蛋白modifierofmdg4[mod(mdg4)]通过与转录因子SuppressorofHairy-wing[Su(Hw)]形成绝缘小体来调控基因转录及细胞凋亡。变态期昆虫的中肠在20E调控下发生程序性细胞死亡(PCD),mod(mdg4)是否参与调控昆虫变态期组织PCD相关基因表达还没有报道。GPCRs是最大的膜蛋白家族,它们参与调控激素、神经递质等激活的细胞生理反应。在果蝇中发现多巴胺GPCR受体可以结合蜕皮激素,家蚕丝腺中GPCR参与了蜕皮激素调控的程序性细胞死亡,但蜕皮激素的GPCR受体及介导的信号途径少有报道。Broad(Br)是一种重要的转录因子,20E调控Br高表达起始变态。在幼虫生长期,JH通过抑制Br表达来抑制20E途径,但给幼虫注射JH却能够上调Br表达并抑制变态过程,JH调控Br表达的分子机制尚未阐明。另外Br蛋白本身的稳定性问题也研究甚少。本论文选择mod(mdg4)、GPCRs和Br作为靶标基因,研究蜕皮激素的非基因组途径及保幼激素抑制变态的分子机理,丰富激素调控昆虫发育的理论知识,为害虫控治提供靶标基因。研究结果与结论1.mod(mdg4)lA蛋白参与激素调控的中肠程序性细胞死亡Mod(mdg4)1A在变态期的表皮、中肠和脂肪体中高表达,并定位于变态期幼虫中肠。当mod(mdg4)1A被干扰后,幼虫变态过程被延迟,中肠PCD被抑制,促进PCD和变态发生的相关基因的转录被显著抑制。20E并不通过经典的EcRB1-USP1基因组途径上调mod(mdg4)1a表达,而Methoprene可以通过JH核受体Met1上调mod(mdg4)1a表达。20E和methoprene可以分别上调mod(mdg4)1a表达,但叠加却抑制mod(mdg4)1a表达。结论：mod(mdg4)1A在20E和JH调控下通过调控基因网络的转录水平参与中肠PCD和变态。2.G蛋白偶联受体ErGPCR在细胞膜上参与蜕皮激素介导的信号途径ErGPCR在幼虫的蜕皮期和变态期高表达。当虫体注射dsErGPCR后,幼虫-蛹的转变和20E应答基因的转录均被抑制,而细胞系过表达ErGPCR增强20E应答基因表达。沉默ErGPCR能够抑制胞内Ca2+浓度增加并抑制20E诱导的Calponin快速入核和磷酸化。T型电压门控钙离子通道抑制剂和经典瞬时受体电压钙离子通道抑制剂能够抑制20E诱导的胞内Ca2+浓度升高,并抑制基因表达和蛋白质磷酸化。N末端缺失的ErGPCR突变体定位于细胞质并不能增强20E相关基因转录。ErGPCR不能与20E类似物[3H]IPonA结合。20E可以通过ErGPCR调控EcRB1-USP1基因组途径,也可以通过ErGPCR而不通过EcRBl-USP1调控mod(mdg4)1A表达。结论：20E通过ErGPCR调控Calponin速入核和磷酸化,诱导胞内Ca2+浓度升高,调控20E应答基因表达并参与幼虫-蛹的转变过程。3.JH通过调控新型BroadⅡ磷酸化抑制变态本研究从棉铃虫中发现一种新型Br蛋白BroadⅡ(BrZ-Ⅱ)。虫体干扰BrZ-Ⅱ后,幼虫的变态过程和20E应答基因的转录均被显著抑制。在幼虫生长时期,BrZ-Ⅱ表达量比较低并处于磷酸化状态；而在变态时期,BrZ-Ⅱ保持高表达的非磷酸化状态。G蛋白偶联受体,磷脂酶C,和蛋白激酶C抑制剂均能抑制JH诱导的BrZ-Ⅱ磷酸化。JH诱导的磷酸化的BrZ-Ⅰ能够与Calponin非编码区的Br结合元件结合。虫体注射JHⅢ诱导BrZ-Ⅱ磷酸化,抑制20E相关基因表达并阻止变态。JH诱导非磷酸化的Calponin与超气门蛋白USP1结合激活JH途径并抑制20E途径。结论：体内JH调控BrZ-Ⅱ磷酸化来介导JH应答基因表达指导幼虫生长；20E调控BrZ-Ⅱ高表达和非磷酸状态参与变态。外源JH诱导BrZ-Ⅱ高表达及磷酸化直接调控Calponin高表达,非磷酸化的Calponin与USP1结合激活JH途径从而抑制20E信号途径并抑制变态过程。4.热休克蛋白90结合BroadⅡ的BTB结构域保持其稳定性和功能在体内和体外Hsp90均能结合BrZ-Ⅱ,Hsp90通过中间结构域与BrZ-Ⅱ的BTB结构域结合。Hsp90抑制剂17-allylamino-17-desmethoxygeldanamycin(17-AAG)能够抑制Hsp90与BrZ-Ⅱ的结合,导致BrZ-Ⅱ蛋白水平降低但不影响BrZ-Ⅱ的mRNA水平。蛋白酶体抑制剂MG-132能够抑制17-AAG诱导的BrZ-Ⅱ降解。BrZ-Ⅱ的BTB结构域缺失或17-AAG预处理能够抑制Hsp90与BrZ-Ⅱ的结合,并抑制BrZ-Ⅱ在20E和JH信号途径中的基因调控功能。结论：Hsp90通过中间结构域与BrZ-Ⅱ的BTB结构域结合。Hsp90与BrZ-Ⅱ的结合对于BrZ-Ⅱ的稳定性及其在20E和JH信号途径中的转录调控功能是必需的。研究成果及科学意义mod(mdg4)1A的研究结果一方面深入阐明了20E和JH相互作用调控昆虫中肠PCD的分子机制,另一方面揭示了20E存在除EcR/USP经典基因组途径之外的信号途径。有关ErGPCR的研究结果为20E非基因组途径提供了新的实验依据,将非基因组途径与基因组途径联系起来,并证明20E存在多种信号途径。JH诱导一种新型Br蛋白BrZ-Ⅱ磷酸化调控JH信号途径中相关基因的转录,并抑制20E诱导的转录复合体的形成进而抑制基因转录阻止变态过程,鉴定了JH途径中BrZ-Ⅱ的直接靶基因,并阐明了JH抑制20E功能的新机制。Hsp90能够与BrZ-Ⅱ结合保持BrZ-Ⅱ蛋白的稳定性及其在20E和JH信号途径中的基因调控功能,发现了Hsp90调控的新客户蛋白BrZ-Ⅱ。
【作者】蔡美娟；
【导师】赵小凡；
【作者基本信息】山东大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】棉铃虫；蜕皮激素；保幼激素；mod(mdg4)1A；细胞程序性死亡；G蛋白偶联受体；非基因组途径；BroadⅡ；磷酸化；变态；热休克蛋白90；

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